吖啶橙染色原理

吖啶橙荧光染色法基本原理：

    吖啶橙（acridine orange，AO）是一种常用荧光染料，吖啶橙与原代细胞内的DNA、RNA都有亲和力，但有一定的特异性，即结合后发不同颜色的荧光，DNA呈亮绿色，而RNA呈橘红色至火红色。此法简便快捷，既可染活原代细胞又可染固定原代细胞。用于直接染色观察活原代细胞或固定染色观察原代细胞均可。吖啶橙对活原代细胞毒性小，配成1×10-4-2×10-4可用于直接染色活原代细胞和进行荧光显微镜观察，但不持久，用固定染色观察法效果更好。

 

材料：

1.盖片单层培养原代细胞；

2.固定剂：95%乙醇或乙酸/甲醇（现配）；

3.吖啶橙：用生理盐水配成1%的干液。使用时再用PBS稀释成1×10-4-2×10-4mol/L pH4.5-5.0的染色液；

4.0.1mol/L的CaCl2；

5.1%乙酸。

 

染色步骤：

1.将盖片单层培养原代细胞从瓶中取出，立即用温Hanks液漂洗3-5s，以去除培养基中血清；

2.投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15-30min，用滤纸接触盖片边缘，盖片微干；

3.用1%乙酸酸化30s；

4.用1×10-4-2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min；

5.用0.1mol/L的CaCl2处理30s-2min；

6.PBS漂洗3次，每次数秒；

7.PBS封片，荧光显微镜下直接观察并拍照；

8.注意事项：观察中应随时填加PBS以避免标本干涸。如用油浸镜观察，需再覆以大盖片盖在附有原代细胞盖片上，保证原代细胞面朝上，用无荧光性油浸镜观察。原代细胞盖片标本在95%乙醇中能保存数日后仍可观察，如退色，再用AO染色。镜下观察，DNA呈翠绿色，RNA呈火红色。 结果：原代细胞核因含DNA呈绿色，细胞质及核仁因含RNA呈红色。